<855> 散射光濁度法和透射光比濁法

1.     介紹

散射光濁度法和透射光比濁法是基于光散射現象原理的分析技術(shù)。光散射是一種物理現象，其中光束由于與足夠小的物質(zhì)粒子相互作用而改變其傳播方向（稱(chēng)為偏轉）。根據麥克斯韋電磁理論，散射發(fā)生的先決條件是懸浮顆粒的折射率必須不同于懸浮液體的折射率。差異越大，散射越強烈。光散射有兩種類(lèi)型：1）彈性散射，其中散射光和入射光的波長(cháng)相同；2）非彈性光散射，其中散射光和入射光的波長(cháng)不同。只有第一種光散射（彈性）與散射光濁度法和透射光比濁法有關(guān)。

在透射光比濁法中，測量透射光的強度，并在入射光方向（即0°）測量散射導致的入射光強度的衰減，并與入射光強度進(jìn)行比較（空白測量）。被測特性是懸浮顆粒散射效應的間接測量，稱(chēng)為濁度。懸浮樣品對光的任何吸收都會(huì )導致光強度的額外衰減（參見(jiàn)<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy和<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice）。因此，確保被測材料不會(huì )吸收測量波長(cháng)處的光非常重要。實(shí)際上，控制吸收和濁度測定的方程式是相同的（盡管衰減常數的值不同）。在散射光濁度法中，測量與入射光傳播方向成90°角的散射光強度。因此，散射光濁度法濁度測量是對懸浮物散射效應的直接測量。

2. 術(shù)語(yǔ)和定義

描述濁度法和濁度法的常用術(shù)語(yǔ)包括：

•濁度（符號S）：由于懸浮顆粒的光散射效應，透射入射光束強度降低的一種度量。懸浮物的量可以通過(guò)觀(guān)察透射光（比濁法）或散射光（濁度法）來(lái)測量。

log I₀/I_t = kbc = T

I₀=入射光強度

I_t=透射光強度

k=摩爾濁度系數

b=樣品池路徑長(cháng)度

c=濃度

T=濁度

•濁度（符號，τ）：在透射光濁度測量中，濁度是給定懸浮液的入射光束強度/單位長(cháng)度減少的量度。國際標準化組織將濁度定義為“由于存在未溶解物質(zhì)而導致液體透明度降低"。

•濁度測量單位：渾濁度單位用一個(gè)描述符表示，該描述符指示測量方法。

•散射光濁度計濁度單位（NTU）：當使用散射光濁度法測量濁度時(shí)，濁度計以與入射光傳播方向成90°角的角度測量散射光，濁度單位稱(chēng)為散射光濁度法濁度單位（NTU）。NTU的大小是根據初級福爾馬肼標準品（一種將硫酸肼和六亞甲基四胺溶液混合在水中制成的懸浮液）產(chǎn)生的濁度定義的。更安全的聚合物微珠懸浮液現已上市，并被*為可接受的替代品。然而，所有這些標準都可以追溯到福爾馬肼。初級福爾馬肼標準溶液的濁度為4000 NTU。

其他*的濁度單位包括福爾馬肼比濁法單位（FTU）和福爾馬肼濁度法單位（FNU）。這些單位相當于0-40 NTU范圍內的NTU。

3.     應用

透射光比濁法和散射光濁度法技術(shù)的應用包括1）溶液和/或懸浮液的濃度測定（通過(guò)在控制良好的反應參數下沉淀和懸浮產(chǎn)生的沉淀物，來(lái)測定幾種陽(yáng)離子和陰離子）；2）測量混濁溶液或懸浮液的濁度；3）測定分子量在1000到數億之間的多分散體系的重均分子量和尺寸；4）測量免疫分析的反應動(dòng)力學(xué)或免疫沉淀動(dòng)力學(xué)（比率散射濁度法）；5）監測細胞和細菌的生長(cháng)；6）懸浮物粒度分布測定、顆粒計數等。

比率散射濁度法廣泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它還用于重組生物制藥中的宿主細胞蛋白質(zhì)鑒定。當使用該技術(shù)時(shí)，通過(guò)測量抗原-抗血清或抗原純化抗體復合物的光散射反應的變化，來(lái)計算導致免疫抗體-抗原沉淀反應或凝集反應的抗原（Ag）或抗體（Ab）的量。通?？紤]抗原共價(jià)連接或吸附在聚合物微球上，以提高散射效率；由此產(chǎn)生的技術(shù)被稱(chēng)為“顆粒增強免疫分析"。雖然這項技術(shù)被稱(chēng)為散射光濁度法，但通常散射光和透射光都是用比率儀器測量的。

散射光法濁度測量在低濁度范圍（散射介質(zhì)濃度相對較低）更可靠。在該范圍內，觀(guān)察到樣品濃度與檢測器信號強度（以NTU表示）之間存在線(xiàn)性關(guān)系。隨著(zhù)濃度的增加，多次散射的入射角也會(huì )增加，從而偏離線(xiàn)性響應。支持可靠線(xiàn)性關(guān)系的最大NTU值在1750–2000 NTU范圍內。透射光比濁法適用于更高的濁度范圍（散射介質(zhì)的濃度）。為了獲得一致的結果，必須仔細控制所有測量變量。在可能的情況下，可以測量極稀的懸浮液。

4. 儀器儀表

用于透射光比濁法和散射光濁度法測量的儀器分別稱(chēng)為透射光濁度計和散射光濁度計。通常，這些儀器包括一個(gè)帶有濾光器的汞燈（用于強綠線(xiàn)或藍線(xiàn)）、一個(gè)快門(mén)、一組具有已知透射率的中性濾光器和一個(gè)靈敏的光電倍增管，該光電倍增管可安裝在與入射光傳播方向成0°或90°角的位置，或者在一個(gè)臂上，它可以圍繞溶液?jiǎn)卧D，并通過(guò)不透光外殼外的表盤(pán)設置為?135°到0°到+135°的任何角度。溶液池的形狀多種多樣，例如用于測量90°散射的正方形；45°、90°和135°散射為半八角形；圓柱形可適用于所有角度的散射（見(jiàn)圖1）。

圖1.代表性濁度儀。注意，探測器2可安裝在可移動(dòng)臂上。

濁度也可以用標準光電濾光光度計或分光光度計測量，最好是在光譜的藍色部分進(jìn)行照明。散射光濁度法測量需要一個(gè)裝有光電管的儀器，以便接收散射光，而不是透射光。由于這與熒光計中使用的幾何結構相同，因此可通過(guò)適當選擇濾光片將其用作濁度計。比率濁度計結合了90°散射光濁度法和透射光比濁法。它包含光電管，接收和測量與樣品成90°角的散射光，以及接收和測量樣品前面的前向散射光。它還測量直接穿過(guò)樣品的光。通過(guò)90°角散射光測量值，前向散射光測量值和透射光測量值之和，計算兩者的比值，可獲得線(xiàn)性度。使用比率濁度測量系統的好處是雜散光的測量變得可以忽略不計。此外，彩色懸浮液的濁度測定僅使用透射光比濁法濁度儀或濁度儀（帶比率模式）進(jìn)行，因為該程序補償了懸浮液顏色導致的光衰減。通常，這些儀器中的光源是鎢燈，在2700 K的燈絲溫度下工作，大部分光強約為550 nm。也可使用其他合適的光源。通常，探測器是▲硅二極管▲和光電倍增管。另一種消除顏色效應的方法是使用紅外發(fā)光二極管作為光源，其最大發(fā)射中心約為860 nm，光譜帶寬為60 nm。當激光光源也被使用時(shí)，尤其是在濁度測量?jì)x器中，這種技術(shù)通常被稱(chēng)為“激光濁度測量"。使用激光散射光濁度計的優(yōu)點(diǎn)是，在非常低的檢測水平下，信噪比顯著(zhù)提高。通常光源是工作波長(cháng)為660 nm的激光二極管。激光束的高功率密度使較小粒子產(chǎn)生更高的散射強度。與吸收未散射光的光阱相結合，該系統可顯著(zhù)降低雜散光。當專(zhuān)著(zhù)中的某個(gè)程序指示使用散射光濁度計或透射光濁度計時(shí)，可以使用在比率模式下工作的儀器。

5. 福爾馬肼濁度標準

福爾馬肼是目前已知的主要濁度標準。所有其他標準都是次要的，必須追溯到福爾馬肼。 主要標準在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲（ERR 1-May-2019）第 2 版（金書(shū)）中被定義為由用戶(hù)使用明確定義的方法和條件從可追溯的材料準備的標準。

福爾馬肼懸浮液有許多特點(diǎn)，以確保其適合作為主要標準。它可以從試劑級的起始材料中始終如一、準確地制備。該懸浮液由不同長(cháng)度和隨機構型的聚合物組成，其組成的聚合物的形狀和尺寸從小于0.1 μm到大于10 μm不等。盡管聚合物鏈長(cháng)分布已被證明因制備而異，但總的濁度結果是可以很好地重現的。

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福爾馬肼標準液的制備

•硫酸肼溶液：將1.000 g ACS級硫酸肼（N₂H₄·H₂SO₄）溶解在100 mL 的A類(lèi)容量瓶中中，并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度。讓該溶液靜置4-6小時(shí)。

•初級福爾馬肼標準液：將2.50 g分析級六亞甲基四胺[(CH₂)₆N₄]溶于25.0 mL無(wú)顆粒水中，裝入100 mL燒瓶。使用A類(lèi)25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液，并充分混合。使用前，讓制劑在25±1°的溫度下靜置48小時(shí)。由此產(chǎn)生的懸浮液可穩定運行2個(gè)月。

•福爾馬肼儲備標準懸浮液1：使用15 mL A類(lèi)移液管，將15 mL福爾馬肼初級標準液轉移至1 L容量瓶中，并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為60 NTU。

•福爾馬肼儲備標準懸浮液2：使用50 mL A類(lèi)移液管，將50 mL福爾馬肼初級標準液轉移至200 mL容量瓶中，并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為1000 NTU。

•福爾馬肼參考懸浮液：根據表1，在100 mL容量瓶中混合各份福爾馬肼儲備標準懸浮液和無(wú)顆粒水，制備福爾馬肼參考懸浮液。